錢(qián)　淵

中國實(shí)用兒科雜志  2019  Vol.34（2）：97-99

摘要

呼吸道感染是兒科最常見(jiàn)的疾病之一，臨床表現多樣，嚴重者可致死亡。病毒是最常見(jiàn)的致病原之一，尤其對于小嬰兒。敏感、特異、快速的病原診斷是正確診治的重要保證。近年來(lái)，新的病毒病原診斷方法不斷涌現，該文就各種診斷技術(shù)和方法的優(yōu)缺點(diǎn)和臨床實(shí)際應用價(jià)值做一闡述。

關(guān)鍵詞

呼吸道感染；病毒；兒童；病原診斷

作者單位：首都兒科研究所病毒研究室  兒童病毒病病原學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗室， 北京  100020
電子信箱：yqianbjc@263.net

急性呼吸道疾病是影響人類(lèi)健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病。病毒感染常常是這些疾病的直接病因或激發(fā)因素，對于兒童（尤其是嬰幼兒）更是如此。兒童呼吸道病毒感染的臨床表現多樣，從輕微的、自限性的上呼吸道感染到嚴重的甚至是致死性的下呼吸道感染，季節性明顯，往往會(huì )在短時(shí)間內引起門(mén)、 急診患兒的突然大幅度增加， 隨之而來(lái)的是住院床位的供不應求，這些都對兒科臨床造成巨大的壓力。因此，兒科醫務(wù)工作者準確識別呼吸道病毒感染，制定恰當的診治策略和應對措施，避免抗生素的過(guò)度使用是個(gè)非常重要的臨床實(shí)際問(wèn)題。

1　兒科呼吸道病毒病原的診斷概況

2000年以前， 兒科最常見(jiàn)的、 經(jīng)典的呼吸道病毒包括： 呼吸道合胞病毒、 流感病毒（甲型和乙型）、 腺病毒、 副流感病毒（1、 2、 3型）。之所以說(shuō)是“最常見(jiàn)的”和“經(jīng)典的”， 是因為這些呼吸道病毒發(fā)現于20世紀50年代以后， 與急性呼吸道感染的病原關(guān)系的確定經(jīng)歷了病毒分離、 血清學(xué)試驗（雙份血清）和流行病學(xué)研究， 因此這些結果和結論翔實(shí)可靠、經(jīng)久不衰。2000年以后，隨著(zhù)分子生物學(xué)技術(shù)的不斷創(chuàng )新、 推廣和應用， 人偏肺病毒、 鼻病毒和副流感病毒（4型）與兒科急性呼吸道感染的關(guān)系逐漸被大家所認識和重視。還有一些新發(fā)的病毒（如博卡病毒）， 雖然病原學(xué)關(guān)系尚待確認， 但是由于較高的檢出率， 也引起了大家的高度關(guān)注［1］ 。

由于新的技術(shù)和方法不斷研發(fā)和推出，現代的病毒感染的病原診斷可以根據各醫院的具體情況選擇不同的技術(shù)和方法，并且可以通過(guò)融會(huì )貫通、聯(lián)合應用多種技術(shù)，使得病毒病原的診斷更加切合患兒的實(shí)際（即不同的病程階段和病情嚴重程度）［1］?？捎玫募夹g(shù)包括病毒分離（僅限于常見(jiàn)呼吸道病毒，仍為不容置疑的金標準）、用各種免疫學(xué)方法檢測病毒抗原（如直接或間接免疫熒光法、酶聯(lián)免疫法、免疫層析法等）和病毒核酸擴增法（檢測病毒的基因-DNA或者RNA）。這三種類(lèi)型是在感染的相應部位檢測病毒；還可以用檢測病毒特異性抗體的方法（血清學(xué)試驗）來(lái)做出病毒病原診斷，要根據患兒的不同的病程階段來(lái)考慮選擇檢測不同的特異性抗體種類(lèi)。具體的方法在這期《中國實(shí)用兒科雜志》有專(zhuān)門(mén)的文章介紹，本文不贅述。本文將結合文獻、國內兒科臨床的具體情況和筆者所在實(shí)驗室的經(jīng)驗和體會(huì )，就當前面對眾多的方法和技術(shù)，兒科醫師和醫院的病毒病原檢測的相關(guān)部門(mén)如何選擇診斷技術(shù)作一個(gè)簡(jiǎn)要論述，以供參考。

1.1　病毒分離　盡管常見(jiàn)呼吸道病毒的分離是公認的、無(wú)可置疑的病原診斷金標準，對于絕大部分的兒童醫院來(lái)說(shuō)還是無(wú)法做到，只有少部分兼做研究的醫院可做。用病毒分離的方法，連續性地每年從患兒的臨床標本中分離到各種呼吸道病毒的流行毒株，對于診斷病毒學(xué)的可持續發(fā)展是一項十分重要、不可或缺的工作［2］。

1.2　病毒抗原檢測　病毒抗原是指在病毒侵入呼吸道上皮細胞后活躍復制、增殖的過(guò)程中產(chǎn)生的病毒蛋白，因為可以在感染過(guò)程中刺激肌體產(chǎn)生相應的抗體而稱(chēng)為抗原。病毒只有在侵入靶細胞并且活躍增殖的情況下才能引起呼吸道癥狀。因此在疾病的早期，抗原檢測（不管采用何種方法）是對于病原確定以便正確診治的好策略！其診斷價(jià)值不亞于傳統的病毒分離或快速病毒分離（shell vial），并且因為出結果快而使得其實(shí)用性?xún)?yōu)于病毒分離［3］。而諸多的抗原檢測方法中，直接或間接免疫熒光法因為需要采集到患兒的呼吸道脫落上皮細胞（呼吸道病毒感染的靶細胞）作為檢測的標本，熒光標記的單克隆抗體與在細胞中病毒感染后增殖的特定部位［細胞核和（或）細胞漿］結合，在熒光顯微鏡下可以直觀(guān)地看到特征性的定位熒光而判斷結果，因此，有很強的特異性。在發(fā)病的早期，抗原檢測即可顯示熒光陽(yáng)性［4］。該方法在采集到高質(zhì)量標本（含足夠量的呼吸道脫落上皮細胞）前提下，敏感性和特異性可以與病毒分離相當；另外，因操作時(shí)間相對較短（2～3 h），符合臨床上敏感、特異和快速的要求［3］，因此，在相當長(cháng)的時(shí)期內成為國內外兒科的病毒診斷實(shí)驗室的首選方法，并且在當前也不失為最好的方法之一，尤其對于住院患兒來(lái)說(shuō)更是推薦選用。目前有商品化的試劑盒，可以用1份標本同時(shí)檢測7種常見(jiàn)的呼吸道病毒（如果加上偏肺病毒的單克隆抗體，可以檢測8種呼吸道病毒，國外的試劑盒是這樣組合的）［5］。 免疫層析法（如金標法等“紙條法”）因為出結果快、操作簡(jiǎn)便（操作人員不需要特殊的技術(shù)專(zhuān)長(cháng)），在臨床上也是十分受歡迎，國外的專(zhuān)科醫師診所（成人及兒科）內由醫師或護士直接操作，國內還是由臨床檢驗部門(mén)來(lái)做。目前國內外應用最多的“紙條法”是流感病毒（甲型/乙型），質(zhì)量好的試劑盒在敏感性和特異性上可與病毒分離相比［6］。國外兒科廣泛應用的免疫層析法還有呼吸道合胞病毒、腺病毒［3］，而國內尚處于開(kāi)始階段。相比免疫熒光法，“紙條法”取1份標本只能做單一的病毒，對標本的質(zhì)量（是否采集到足夠量的上皮細胞）也無(wú)法判斷，故對于普遍反映該方法的敏感性低的問(wèn)題筆者在此難以評價(jià)。

1.3　病毒核酸檢測　病毒核酸檢測是隨著(zhù)20世紀80年代末聚合酶鏈反應（PCR）技術(shù)發(fā)明以來(lái)快速發(fā)展起來(lái)的。由于與抗原檢測相比，核酸擴增技術(shù)的敏感性大大的增加了檢出率，而且實(shí)時(shí)熒光PCR或RT-PCR又可以克服早期PCR技術(shù)的實(shí)驗室污染問(wèn)題的瓶頸，使得核酸檢測在呼吸道病毒病原診斷中快速地得到推廣應用。近年來(lái)，多重PCR技術(shù)使得用同一管反應能夠同時(shí)檢測幾乎所有的呼吸道病毒，而且隨著(zhù)反應時(shí)間的縮短，儀器的日漸小型化，在一些實(shí)驗室多重核酸檢測的技術(shù)逐步取代了抗原檢測，尤其是當一些新上市的試劑盒是以“癥狀為組合”為設計理念的（developed as syndromic panels），加上了如肺炎支原體、肺炎衣原體等呼吸道病毒以外的常見(jiàn)病原，更加受到了臨床的青睞。然而盡管有這些突出的優(yōu)點(diǎn)，核酸檢測的短處也日益顯露出來(lái)。首先，核酸擴增法檢測過(guò)于靈敏，有極少量的病毒基因也能被檢測到，而且由于可檢測到病毒核酸的時(shí)間窗長(cháng)，陽(yáng)性結果不能明確告訴醫師是本次感染的病毒病原，還是以前（上次）感染遺留的病毒核酸，該病毒是否還有感染性（傳染性）［7］。多重PCR還往往得到兩種以上病毒同時(shí)陽(yáng)性的結果，以至于很難判斷哪種病毒是本次臨床疾病的病原；這種情況在抗原檢測中就很少發(fā)生，因為抗原檢測法得到的是病毒活躍增殖中產(chǎn)生的病毒蛋白，而且在發(fā)病早期出現，陽(yáng)性結果維持時(shí)間不長(cháng)，在急性呼吸道感染中，陽(yáng)性結果從臨床癥狀出現時(shí)起，一般維持7 d左右（最長(cháng)不超過(guò)10 d）并呈逐漸減弱的趨勢。所以，抗原檢測仍然有著(zhù)其他方法所缺乏的優(yōu)勢［3］，那就是與病毒活躍增殖的密切相關(guān)性所決定的對病原診斷的可靠性。

2    兒科呼吸道病毒病原的診斷所面臨的挑戰

盡管病毒病原診斷的技術(shù)日新月異，也被越來(lái)越多的醫院臨床所接受應用，呼吸道病毒病原的診斷仍然面臨著(zhù)嚴峻的挑戰。

最突出的是理念的挑戰！有一種觀(guān)點(diǎn)非常具有代表性，那就是由于大多數呼吸道病毒缺乏特異的治療藥物，臨床醫師會(huì )認為準確的病毒病原診斷的實(shí)際意義不大，根據血常規、C反應蛋白等檢測結果判斷是病毒感染，對癥治療就是了。這種想法阻礙了病毒病原的診斷。實(shí)際上不同的病毒所引起的疾病預后是不一樣的，不同的呼吸道病毒可能引起相似的臨床表現，而有了準確的病原診斷，一定會(huì )促進(jìn)臨床的診斷和治療。例如，在當前（2018—2019年流感季）流感流行中，如果沒(méi)有流感病毒的病原診斷，不會(huì )使臨床醫師認識流感合并的腦病，會(huì )把腦病當成一般的病毒性腦炎和腦膜炎，而忽略流感本身。還有，即使在流感高峰季節，流感樣病例中仍有相當一部分是由流感病毒以外的呼吸道病毒引起的，如果不做病原檢測而盲目使用抗流感藥物，會(huì )使得耐藥毒株快速生成。因此，臨床醫師對病原檢測必要性的認識是十分重要的，臨床醫師的需求直接影響了一個(gè)醫院的病毒病原診斷的應用、發(fā)展和進(jìn)步。 

其次，盡管目前市場(chǎng)上供應的診斷試劑很多，而且還在不斷增加，可應用于臨床的（即有批準文號的）診斷試劑遠遠不能滿(mǎn)足需求，而且良莠并存，因此，在應用于臨床前，應該認真地做好擬采用的試劑盒的質(zhì)控和評估，最理想的是與公認的標準方法進(jìn)行比較，以保證檢測質(zhì)量的可靠性，這在發(fā)達國家的臨床檢驗科已經(jīng)是常規了，在國內可能大部分的兒科醫院都做不到，所以會(huì )對檢測結果的可靠性大打折扣。此外，在應用了某一種診斷方法和試劑一段時(shí)間后，應該及時(shí)總結和回顧所用試劑的敏感性、特異性和可靠性，加強同臨床醫師的溝通，以不斷改進(jìn)。

最后，也是不能忽視的最重要的一點(diǎn)，采集到合格的標本是取得可信結果的第一步，也是基本保證！臨床上要對采集標本的人員（住院醫師或護士）進(jìn)行培訓，而檢驗人員應該對送來(lái)的標本進(jìn)行初步評估，看是否真正采集到了符合要求的標本。因為只有病毒在細胞內快速增殖才能引起相應的疾病，檢測到的結果才是真正可信的結果。對于不合格的標本，不能簡(jiǎn)單地打上“陰性”了事，而要注明標本“不合格”，以便于臨床醫師對結果做出客觀(guān)的判斷。

3    結語(yǔ)與展望

盡管與發(fā)達國家相比，我們的呼吸道病毒病原診斷的廣度和深度都存在著(zhù)很大的差距，但是我們的進(jìn)步已經(jīng)在路上?！吨袊鴮?shí)用兒科雜志》作為在我國兒科同行中頗具影響力的學(xué)術(shù)期刊，本期重點(diǎn)選題的設計和實(shí)施就是有力的說(shuō)明！相信隨著(zhù)病毒病原診斷技術(shù)的不斷進(jìn)步發(fā)展和普及應用，兒科同道們對病毒性呼吸道感染的認識和診治水平會(huì )得到長(cháng)足的進(jìn)步，這是一項使醫患雙方都能獲益的舉措。

參考文獻 (略)